دیابت یک بیماری ساده نیست، بلکه سندرم پیچیده­ای است که بارزترین ویژگی آن افزایش قند خون است. بنابراین، بیماران دیابتی هر چند در یک ویژگی به هم می­مانند، اما هم از نظر بالینی و هم از نظر آسیب شناسی و ژنتیکی ناهمگون هستند. این بیماری در سال 1980 میلادی این گونه تعریف شد: گروهی از نارسایی­ها که ویژگی اصلی آن­ها افزایش بیش از اندازه­ی گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پیامد کمبود انسولین یا نارسایی در کارکرد انسولین و یا آمیزه­ای از این دو است. عوارض ناشی از دیابت در 25% موارد، نارسایی کلیه و در 50% موارد قطع عضو و نابینایی است (Tehranipour et al., 2008). گیاهان دارویی از قدیم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزایش کیفیت و طول زندگی در افراد دیابتی به کار گرفته شده است. با توجه به این که گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی اثر جانبی کمتری دارند، بنابراین پژوهشگران به دنبال یافتن ترکیبهای گیاهی برای درمان و یا پیشگیری از این بیماری هستند. گیاه جغجغه (Prosopis farcta) گیاهی با خواص ضد التهاب و ضد دیابتی است. اهمیت فعالیت فسفوفروکتوکیناز 1 نه تنها از این جنبه است که واکنشی به شدت انرژی زا را کنترل می کند بلکه اولین مرحله در واکنش­های گلیکولایزیز است که واکنش یکطرفه بوده و برگشت ناپذیر است. این باعث می­گردد که کنترل شدیدی بر روی میزان گلوکز و دیگر مونوساکاریدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آید.. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر میزان بیان ژن پیروات کیناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌های صحرایی نر دیابتی می‌باشد.

 

2-1- کلیات تحقیق

 

1-2-1- دیابت

 

دیابت ملیتوس شامل بیماریهای متابولیکی است که مشخصه آن افزایش مزمن قند خون و اختلالات متابولیسم کربوهیدرات­ها، چربی­ها و پروتئین­ها می باشد. این بیماری در نتیجه­ی وجود نقص در ترشح انسولین، عملکرد انسولین یا هر دو ایجاد می­گردد. افزایش مزمن قند خون در حالت ناشتا یا بعد از خوردن غذا مسئول عمده­ی  عوارض کوتاه اثر و بلند مدت این بیماری می باشد که تمام سیستم­ها و اندام­های بدن را تحت تاثیر قرار میدهند. این بیماری شایعترین علت بیماریهای کلیوی مرحله نهایی، موارد جدید نابینایی و قطع اندام تحتانی غیرترومایی را به خود اختصاص می­دهد. بیماری قلبی عروقی در افراد دیابتی 2 تا 4 برابر نسبت به افراد عادی شایعتر  است و در افراد بالاتر از 25 سال 18٪ تمام بیماری­ها را شامل می­ گردد.

 

2-2-1- انواع دیابت

 

   دیابت به دو دسته­ی اصلی وابسته به انسولین (دیابت نوع 1) و دیابت غیر وابسته به انسولین (دیابت نوع 2) تقسیم می­شود. همچنین گونه دیگر با نام دیابت بارداری (Gestational) که در دوران بارداری بروز کرده و پس از آن بهبود می یابد.

 

در دیابت نوع 1  که از انواع شایع بیماریهای  خود ایمن  است سیستم ایمنی بدن سلول­هایβ سازنده انسولین در پانکراس را تخریب می­کند. این نوع دیابت بسیار سریعتر از سایر فرم­های دیابت پیشرفت می­کند و معمولا در کودکان و نوجوانان بالغ، بعضی اوقات در جوانان بالغ دیده می­شود. این بیماران باید بطور منظم انسولین تزریق کنند. همچنین به این دیابت، دیابت جوانان یا دیابت ملیتوس وابسته به انسولین نیز می­گویند. اما این اصطلاح نمی­تواند کاملا دقیق باشد برای اینکه این کودکان می­توانند به سایر فرم­های دیابت مبتلا شوند. یک فرم دیگر از دیابت نوع 1 که در سنین بالا معمولا بعد از سی سالگی رخ می­دهد LADAگفته می­شود. افراد مبتلا به این نوع دیابت فاقد شاخص­های ایمونولوژیکی هستند که حاکی از روند تخریب خود ایمنی سلول­های β باشد با  این وجود این بیماران بواسطه­ی مکانیسم­های نامشخصی دچار کمبود انسولین می­شوند. گاهی اوقات بیماران مبتلا به دیابت اتوایمیون به دلیل افزایش وزن و فاکتورهای ژنتیکی به انسولین مقاوم می­شوند به این شرایط دیابت مضاعفگفته می­شود.

 

فاکتورهای قابل کنترلی مانند شیوه زندگی ناسالم، پرخوری، کم تحرکی، چاقی، می­توانند توانایی بدن را در استفاده از انسولین مختل کنند. همچنین فاکتورهای غیر قابل کنترلی مانند ژنتیک، تاریخچه­ی خانوادگی دیابتی، سن نیز در این فرایند درگیرند. فرم­های متابولیک دیابت شامل دیابت بارداری و دیابت نوع 2 می­باشند. بیماری دیابت بارداری، فرم موقت دیابت است و در دوران بارداری در هر زن غیردیابتی می­تواند رخ دهد. تغییرات هورمونی، همراه با وزن زیاد و تاریچه خانوادگی دیابتی در ابتلا به این بیماری نقش دارند. بر اساس گزارش

 موسسه آمریکایی دیابت حدود 4% از زنان در طول دوران بارداری به این فرم از دیابت مبتلا می­شوند. این بیماری می­تواند مشکلاتی مانند تولد جنین نارس، یرقان و مشکلات تنفسی برای مادر و کودک ایجاد کند. این بیماری بعد از زایمان بهبود می­یابد ولی مادر و کودک در سنین بالاتر استعداد ابتلا به دیابت نوع 2 را دارند (Riaz, 2009). دیابت نوع 2 شایعترین نوع دیابت بوده و90٪ موارد بیماری دیابت را به خود اختصاص داده است. شیوع دیابت نوع 2 پیوسته در حال افزایش است و میزان بروز دیابت نوع 2 در کودکان تقریبا ده برابر شده است.

 

1-2-3- علائم بروز دیابت

 

علایم بروز دیابت، به نوع دیابت و اینکه فرایند بیماری در چه مرحله­ای باشد بستگی دارد. مبتلابان به دیابت نوع 1 معمولا با علایم حاد کلاسیک هیپرگلیسمی شامل: پرنوشی، پرادراری، کاهش وزن و به میزان کمتر پرخوری، تاری دید و خارش مراجعه می­کنند. در بیست و پنج درصد مبتلایان نشانه بروز بیماری برای اولین بار کتواسیدوز دیابتی است. در مبتلایان به دیابت نوع 2 اغلب چندین سال قبل از تشخیص بیماری وجود دارد. معمولا علائم نسبت به نوع 1 کمتر به صورت حاد بروز می­کند و ممکن است در افراد مسن­تر همراه با لتارژی و خستگی دیده شود. افزایش مزمن قند خون ممکن است با اختلال رشد، حساس بودن به عفونتها و ترمیم تاخیری زخم همراه می­باشد.

 

برخلاف بیماری­های تک ژنی، بروز بیماری توسط آلل موتانت در یک جایگاه ژنی تحت تاثیر قرار می­گیرد، در بیماری­هایی شبیه به دیابت نوع 2 بروز بیماری به چندین جایگاه ژنی که دارای اثر کوچک تا متوسط هستند، بستگی دارد. دیابت نوع 2، بیماری چند عاملی است که در آن ژنها نه تنها با یکدیگر، بلکه با عوامل محیطی نیز در تعامل اند. این احتمال وجود دارد که فعالیت و ترشح انسولین هر دو تحت کنترل واریانت­های ژنتیکی در جایگاه­های ژنی مختلف باشند. براساس مدل مولتی فاکتوریال، استعداد ابتلا به بیماری می­تواند به وسیله­ی ترکیبی از واریانت­های ژنتیکی متعدد و فاکتورهای محیطی تعیین شود. استعداد ژنتیکی افراد لزوما باعث سندروم آشکار نمی­شود مگر اینکه آنها در معرض عوامل محیطی ویژه­ای قرار گیرند.

 

1-2-4- درمان دیابت

 

کمیته متخصصین سازمان بهداشت جهانی در سال 1980 توصیه کرده است که روش­های سنتی درمان دیابت، بیشتر مورد بررسی قرار گیرند، زیرا مرگ ناشی از دیابت در حال افزایش بوده و همچنین مشکلاتی در استفاده از داروهای رایج فعلی وجود دارد (Suba et al., 2004).  به طور سنتی در طول تاریخ از گیاهان متفاوتی برای کاهش قندخون و بهبود اثرات دیابت، استفاده شده و در طب سنتی ایران و سایر کشورهای جهان، اطلاعات کمابیش مفصلی در این رابطه به چشم می­خورد. داروهای گیاهی به خاطر کم بودن اثرات جانبی، در دسترس بودن، هزینه نسبتا کم و مؤثر بودن­ آنها، به طور وسیع در سرتاسر جهان مورد تجویز واقع می­شوند (Venkates et al., 2003).

 

چندین نوع داروی کاهش دهنده گلوکز وجود دارد که از طریق مکانیزم­های مختلف، اثرات ضد­دیابتی خود را اعمال می­کنند. از جمله این مکانیسم­ها می­توان به تحریک ترشح انسولین توسط داروهای خانواده سولفونیل اوره و مگلیتینیدها (Meglitinides)، افزایش جذب محیطی گلوکز توسط بای­گوانیدها (Biguanides) و تیازولیدین­دیون­ها (Thiazolidinediones)، به تأخیر انداختن جذب کربوهیدرات­ها از روده توسط مهارکننده­های آلفا_ گلوکوزیداز، کاهش گلوکونئوژنز کبدی توسط بای­گوانیدها و تیازولیدین­دیون­ها (Modi, 2007)، افزایش غلظت سرمی GLP-1 و کاهش خالی شدن معده توسط آنالوگ­های پپتیدی جدید مانند اگزناتیدها (Exenatide) و لیراگلوتیدها (Liraglutide) و مهارکننده­های DPP-4 اشاره کرد (Hui et al., 2005). این درمان­ها دارای معایبی نظیر توسعه­ی مقاومت دارویی، اثرات جانبی و حتی سمی بودن تا کمبود پاسخ­دهی می­باشند. به عنوان مثال سولفونیل اوره­ها در مدت 6 سال کارایی خود را در 44 درصد بیماران از دست می­دهند. 3/2 از داروهای تجویز شده برای کودکان مؤثر نیستند ( Michal et al., 2005 and Defronzo, 1999). به علاوه هیچ کدام از این داروهای کاهش دهنده­ی گلوکز به طور مؤثر افزایش لیپیدهای خون را کنترل نمی­کنند (Derek, 2001). با شیوع در حال افزایش دیابت در جمعیت روستایی و به علت اثرات نامساعد داروهای صناعی، یک نیاز آشکار برای توسعه­ی منابع گیاهی طبیعی برای داروهای ضد دیابت وجود دارد (Venkatesh et al., 2003). همچنین اثرات جانبی داروها و تداخلات آنها با یکدیگر که در بدن انسان یا در هنگام آزمایش­های مختلف آشکار می­شود نیز مسأله مهمی است که باید مدنظر باشد (Bathaie et al., 2001). مواد مؤثر موجود در گیاهان دارویی مختلف، از طریق مکانیزم­های متفاوتی قادر به کاهش قند خون هستند. عمده­ی این مکانیزم­ها عبارتند از: افزایش ترشح انسولین، فعال کردن مسیر کاتابولیسم گلوکز، مهار یا غیر فعال کردن مسیر گلوکونئوژنز، هدایت گلوکز به داخل سلول، جذب گلوکز آزاد و ممانعت از اتصال آن به پروتئین­ها، افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانی و ممانعت از آسیب­زایی اکسیدان­های تولید شده در مسیرهای مختلف که ممکن است ناشی از ازدیاد گلوکز و تولید محصولات نهایی گلیکه یا سایر مسیرهای متابولیک باشد و سرانجام ممانعت از جذب گلوکز از روده. (بطحایی و همکاران، 1391). یکی از مهمترین مسائل مورد توجه در علوم پزشکی و حتی تجارت جهانی به تولید، فرآوری و استفاده از گیاهان دارویی می­باشد (Pirzad et al., 2006).  به ­طوریکه بعد از اسلحه سازی دومین صنعت پول ساز بزرگ جهان تولید و تجارت داروئی می­باشد (Riazi,1997).در سال 2008 سرمایه در گردش بازار جهانی گیاهان دارویی تا سال 2005 بالغ بر 5 تریلیون دلار گردد (امید بیگی، 1379). چین سالانه 8 میلیارد دلار از تولید گیاهان دارویی در­آمد کسب می­کند. در ایران با وجود حجم عظیم منابع گیاهان دارویی، بخشی از نیاز جامعه از کشورهایی مثل هند وارد می­شود (افشار، 1385). در حال حاضر سطح زیرکشت گیاهان دارویی در ایران 91 هزار هکتار و میزان تولید این محصولات 100 هزار تن است. صادرات گیاهان دارویی ایران در سال 1384 کمتر از 40 میلیون دلار بود (افشار، 1385). در حالیکه در سال 1387حجم مبادلات دارویی ایران به 89 میلیون دلار رسید (زمانی و همکاران، 1387). بشر همواره جهت رفع نارسائی­ها و بیماریهای خود نیاز به استفاده از داروهای طبیعی داشته و دارد. اهمیت تولید و فرآوری گیاهان دارویی بدلیل عوارض جانبی کمتر، عدم توانایی در تولید برخی داروها و همچنین هزینه بالای تولید بسیاری از مواد دارویی، روز به روز در حال افزایش است و بیشتر کشورها سرمایه گذاری زیادی را در راستای تولید گیاهان دارویی انجام داده­اند (letchamo, 2006). در حال حاضر یک سوم داروهای مورد استفاده بشر را داروهای با منشاء گیاهی تشکیل می­دهند و این میزان به شدت رو به افزایش است (امید بیگی، 1379).

 

[1] Dipeptidyl Peptidas-1

 

[2] Dipeptidyl Peptidas-4

 

[1]latent autoimmune diabetes ofadulthood

 

[2]double diabetes

امروزه بیماریهای عفونی ناشی از میکروارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب میشود و هزینه های زیادی برای درمان آنها اختصاص داده می شود. به همین علت نیاز به یافتن آنتی بیوتیکهای جدید و افزایش کارایی آنتی بیوتیکهای شناخته شده، بالا بردن بازده تولید و اقتصادی تر کردن فرایندهای تولید بسیار مهم می باشد. آنتی بیوتیکها مهمترین فراورده دنیای میکروبها هستند و جز پرمصرفترین داروها می باشند. کشف پنی سیلین توسط فلمینگ در سال 1929 را میتوان آغاز عصر آنتی بیوتیکها دانست. در تعریف کلی آنتی بیوتیک به ماده شیمیایی گفته میشود که توسط میکروارگانیسم تولید شده و میتواند بصورت انتخابی رشد سایر میکرو ارگانیسمها و یا تومورهای بدخیم را متوقف کند. امروزه این داروها در دامپزشکی هم کاربرد دارد و به عنوان ماده افزودنی در غذای حیوانات به کار می رود و همچنین به عنوان مواد حافظ گیاهان و غذاها نیز به کار میروند. بر اساس پیش بینی های انجام شده میزان مصرف این دارو در سال 2013 بیش از 40 میلیارد دلار میباشد و این میزان رو به افزایش خواهد بود. پس میتوان گفت که آنتی بیوتیکها اهمیت اقتصادی زیادی دارند. یکی از آنتی بیوتیکهای مهم و پرمصرف مورد استفاده اریترومایسین است که در درمان طیف وسیعی از بیماریها کاربرد دارد. این دارو جز ماکرولیدهاست و فرمول شیمیایی آنH H 67 NO13 و وزن ملکولی آن 94/733 گرم بر مول است.این آنتی بیوتیک با اتصال به زیر واحد 50 S ریبوزوم باکتریایی ممانعت کننده سنتز پروتئین هستند. لازم به ذکر است که پروتئینهای L15 و L16 در اتصال اریترومایسین به زیر واحد ریبوزوم نقش دارند. در پیکره اریترومایسین یک حلقه لاکتونی بزرگ وجود دارد که 13 کربنی است. همچنین یک قند آمین دار به نام دزز آمین دارد که با پیوند گلیکوزیدی به هسته لاکتونی متصل است. اریترومایسین یک ترکیب کریستالی بی رنگ است که در آب

 کم محلول است ولی در بسیاری از حلالهای آلی مانند استن به خوبی قابل حل است. اریترومایسین یک باز ضعیف است و طعم تلخی دارد. این دارو باکتریو استاتیک است ولی در غلظتهای بالا باکتریوساید میشود. این دارو برای درمان برنشیت، زخمهای عفونی،دیفتری، گلودرد،تب مخملک و … موثر است. بازار مصرف این دارو اکنون دارای رشد 6 تا 8 درصد افزایش تولید در سال میباشد. آمار مصرف آن در ایران در سال 89 ، 2/11 میلیارد تومان گزارش شده است.

اریترومایسین علیه ارگانیسمهای گرم مثبت نظیر استرپتوکوک، استافیلوکوک، پنوموکوک و ارگانیسمهای گرم منفی مثل نایسریا و بردتلا پرتوسیس موثر است.این دارو جایگزین مناسبی برای پنی سیلین در افراد آلرژیک نسبت به پنی سیلین است.  با توجه به این نکته تلاش برای بهینه سازی و کاهش قیمت روند تولید این دارو با اهمیت است و در این پژوهش سعی بر این شده که راه حلی برای کاهش قیمت و بومی سازی تولید این دارو پیدا شود. به طور کلی فرآیند تولید آنتی بیوتیکها شامل 5 مرحله اصلی است .آنچه در این پژوهش بیشتر مدنظر است ، تغییر در ترکیبات محیط کشت به کار رفته در مرحله تخمیر است. عمل تخمیر در فرمانتور یا بیوراکتور انجام میشود. یک فرایند تخمیری به روشهای غیر مداوم، مداوم و نیمه بسته انجام میشود.عواملی در طی یک فرایند تخمیر بیشترین اهمیت را دارند و محققان با تغییر در شرایط آنها سعی در بالا بردن بازده و کاهش هزینه های تولید دارند. این عوامل عبارتند از : ترکیبات محیط کشت، درجه حرارت، هوادهی، pH ، همزنی، دی اکسید کربن، کف، استرلیزه بودن محیط و ظروف.

 

در تهیه محیط کشت، تاکید زیادی روی کنترل کردن بهای مواد خام میشود. زیرا این مواد میتوانند تاثیر مهمی روی محصول نهایی بگذارند. از جمله معیارهای دیگر برای انتخاب مواد خام :

 

– حداکثر بازدهی محصول به ازای هر گرم سوبسترا فراهم کند.

 

– حداکثر غلظت محصول را فراهم کند و اجازه حداکثر سرعت تولید را بدهد.

 

– ارزان باشد و در طول سال با کیفیت یکسان و به راحتی در دسترس باشد.

 

– حداقل مشکلات را در جنبه های دیگر فرایند مخصوصا هوادهی و هم زدن و خالص سازی و استخراج و…. فراهم کند.

 

از جمله منابع گوناگونی که در محیط کشت تخمیر مورد استفاده قرار می گیرند منابع کربنی مثل عصاره مالت، نشاسته، دکسترین، روغن سویا  و منابع نیتروژنی هستند. نیتروژن غیر آلی بصورت سولفات آمونیوم به کار می رود. منابع نیتروژن آلی مثل اوره و پروتئین ها می باشد. بهینه سازی ترکیبات محیط کشت یکی از روشهای کارامد و عوامل موثر برای افزایش تولید فراورده های بیوتکنولوژیک می باشد و در این راه منابع نیتروژنی سهم زیادی دارند. کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان دو منبع نیتروژنی اصلی دارای یکسری ویژگی هایی هستند که باعث گردیده استفاده از آنها در صنعت تولید آنتی بیوتیک مقرون به صرفه باشد و موجب خودکفایی کشور در این زمینه میشوند. برخی از این ویژگی ها عبارتند از:

 

– ترکیب شیمیایی مناسب برای فراهم کردن منبع نیتروژنی فرمولاسیون محیط کشت تخمیر

 

– تولید فراوان سویا و کلزا در داخل کشور ( بومی سازی )

 

– ارزان و در دسترس بودن

 

3-1- ضرورت انجام تحقیق

 

از آنجا که اریترومایسین از جمله آنتی بیوتیک های مهم ، وسیع الطیف و پر کاربرد در کشور می باشد، لذا بومی کردن و مقرون به صرفه کردن فرآیند تولید آن ، از ضروریات انجام تحقیق می باشد.

و مروری بر مطالعات گذشته

 

 

 

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

 

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

 

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

 

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

 

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

 

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از

 سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

 

1-1- سلول­های بنیادی جنینی

 

اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[

 

این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[

 

 این سلول­ها از توده سلولی داخلی بلاستوسیست جداسازی می­شوند که دارای توانایی تمایز و    تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند، این ویژگی را Pluripotent  می­نامند. محققین اولین بار این سلول­ها را از mice  و اخیرا” از انسان و پریمات­ها جداسازی کرده­اند] 22، 23[. یک نکته مورد توجه در ارتباط با سلول­های بنیادی جنینی موش این است که این سلول­ها پس از آنکه در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی قرار می­گیرند، تکثیر شده و بعد از پیوند به جنین­ در مرحله قبل از کاشته شدن، ویژگی پلوری­پوتنتی خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافت­های تمایز نیافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را تولید کنند ]7، 24[ مشابه همین ویژگی­ها در سلول­های بنیادی جنینی انسان نیز دیده شده است ]7[. بنابراین گرچه سلول­های بنیادی جنینی از قدرت تكثیر و تمایز بالایی برخوردارند اما كاربرد این سلول­ها با موانع اخلاقی و قانونی همراه بوده و پاسخ ایمنی را در فرد گیرنده افزایش می‌دهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتی سلو­ل­های بنیادی جنینی انسان یا موش به حیوانات  متولد شده پیوند زده می­شودند تولید تومور می­کنند که حاوی انواع متفاوتی از بافت­ها شامل: پوست، مو و عضله می­باشد که تراتوما نامیده می­شود ]25[، حضور سلول­هایی از سه لایه جنینی در این تومور، نشان دهنده ظرفیت تمایزی بالای این سلول­هاست بنابراین استفاده درمانی از این سلول­ها با مشکلاتی همراه است]7[.

 

2-1- سلول­های بنیادی بالغ

 

سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بافتی که از آن منشا می­گیرند، تمایز یابند. این سلول­ها را می‌توان در بافت­هایی مثل استخوان تیغه‌ای (ترابكولار)، بافت چربی، مغز، سینوویوم، عضله اسكلتی، ریه، طحال، كبد، كلیه، مغز استخوان، غضروف، قلب، پوست، دندان­های شیری و سلول­های اطراف عروق مربوط به ژله‌ وارتون بند ناف انسان نیز مشاهده نمود [14،26]. یکی از نکات مهم در مورد سلول­های بنیادی بالغ این است که تعداد آن­ها در هر بافتی محدود است. این سلول­ها در حالت عادی در ناحیه خاصی از هر بافت به صورت خاموش به حالت تقسیم نشده وجود دارند و قادرند تحت شرایط فیزیولوژیك یا بدنبال ایجاد ضایعه، به سلول­های بافتی كه در آن قرار دارند تمایز یابند و بافت آسیب دیده را ترمیم كنند و یا تحت شرایط خاصی نیز به به سلول­های دیگری كه مربوط به آن بافت خاص نمی‌باشد تمایز می‌‌یابند، به این ویژگی Trans-differentiation و یا Adult­ stem cell plasticity می‌گویند [3،27،28].

 

Ferrari و همکارانش در سال 1998 اولین بار differentiatio Trans- سلول­های BMSCs  را به سلول­های عضلانی و در همان سال Shi و همکارانش تولید سلول­های اندوتلیال از BMSCs را گزارش دادند]29،30[.Petersen  تولید سلول­های کبدی از مغز استخوان را بعد از آسیب کبدی و Brazelton و همکارانش در سال 2000  تولید نورون از  BMSCs را گزارش دادند ]31،32 .[در سلول­های استخراج شده از بافت­های دیگر مانند عضله اسکلتی ]33 [و مغز ]34 [نیز این قابلیت تمایزی مشاهده شده است. امروزه فناوری سلول­های بنیادی و قابلیت تمایز آن­ها به انواع سلول­های بالغ و همچنین استفاده از آن­ها در درمان بیماری­ها به طور روز افزونی در حال پیشرفت بوده که امیدواری­هایی را در جهت ایجاد روش­های مبتنی بر سلول درمانی به عنوان یک جایگزین مناسب برای پیوند اندام کامل ایجاد نموده است.

 

1 progenitor

 

2  Niche

 

3 symmetric

 

4 asymmetric

 

1 Totipotent

 

2 Pluripotent

 

3 Inner cell mass

 

4 Multipotent

 

5 adult Stem Cell

 

6 Embryonic Stem Cell

………………………………………………………………………………………….. 3

 

فصل اول: کلیات

 

1-1 تعریف بیماری لیشمانیوز………………………………………………………………… 6

 

1-1-2 تاریخچه لیشمانیوز در جهان………………………………………………………….. 7

 

1-1-3 تاریخچه لیشمانیوز در ایران……………………………………………………………. 8

 

1-2 رده­بندی و طبقه­بندی انگل لیشمانیا…………………………………………………… 9

 

1-3 مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا……………………………………………… 11

 

1-3-1-1 مورفولوژی انگل……………………………………………………………………… 11

 

1-3-1-2 شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)…………………………………. 11

 

1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستیگوت)…………………………………………………….. 12

 

1-3-2-1 سیر تکاملی انگل……………………………………………………………………. 15

 

1-3-2-2 سیر تكاملی انگل در بدن حشره…………………………………………………… 15

 

1-3-2-3 پشه خاكی……………………………………………………………………………. 15

 

1-3-2-4 سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار…………………………………………. 16

 

1-4  راههای انتقال لیشمانیا به انسان……………………………………………………….. 18

 

1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی………………………………………………………. 19

 

1-4-2  انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19

 

1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19

 

1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19

 

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20

 

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19

 

1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20

 

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21

 

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22

 

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23

 

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24

 

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24

 

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………………………………………………………… 25

 

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25

 

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25

 

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26

 

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26

 

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….

 

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28

 

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28

 

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28

 

1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD+4……………………………………………………..

 

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30

 

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30

 

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31

 

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31

 

1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32

 

1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32

 

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32

 

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33

 

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33

 

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34

 

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35

 

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35

 

1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43

 

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43

 

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43

 

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌…………………………………………………

 

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44

 

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….

 

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..

 

3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45

 

3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46

 

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46

 

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46

 

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….

 

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….

 

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………

 

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50

 

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50

 

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…. 52

 

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53

 

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………….. 53

 

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54

 

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..

 

3-5-4 آماده­سازی نمونه………………………………………………………………………….. 57

 

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57

 

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….

 

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………

 

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..

 

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..

 

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..

 

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61

 

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..

 

3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….

 

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..

 

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66

 

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67

 

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………… 67

 

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………..

 

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….

 

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69

 

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution………………………

 

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها…………………………………………… 72

 

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford………………………………..

 

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………

 

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………………………………….

 

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C…………………………………………….

 

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………….

 

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76

 

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A

 

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….

 

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی………………………………. 79

 

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79

 

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82

 

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

منابع……………………………………………………………………………………………… 95

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106

 

خلاصه فارسی:

 

لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

 

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

 

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­ کلون­ های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

 

یافته ­ها: اطلاعات نشان دادند که تک­ کلون­های جداشده توانایی القاء واکنش­های درون­تنی و برون­تنی قابل مقایسه­ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی­ژن خالص و هموژن را در تست­های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند

 

 

 

انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود(99).

 

به بیماری­های حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته می­شود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی می­باشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL)[1]، جلدی مخاطی (ML)[2] و احشایی (VL)[3] بروز می­کند(57،83).

 

عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در  بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماری­ها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).

 

سازمان بهداشت جهانی آن را  در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز می­باشد(49).

 

افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راه­های مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.

 

فصل اول: کلیات

 

تعریف بیماری لیشمانیوز:

 

انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا  یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگل­ها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).

 

این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).

 

یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزوم­های ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم می­گردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).

 

میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان پستاندار وخزنده است که میزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
می­باشد(20،92،69،101).

 

 

 

عامل بیماری­زایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN[1] دیده می­شود (3).

2-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در جهان

 

کانینگهام[1] در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان[2] در طحال سربازی که از تب دام دام[3] در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.

 

در همین سال دونووان[4]  در مدرسه هندوستان اجسامی شبیه به آن چه لیشمان در بیماری دام دام یافته بود در طحال بیمارانی که مبتلا به تب های نامرتب می­شدند مشاهده کرد. امروزه به تب دام و سایر بیماری های شبیه به آن لیشمانیوز احشایی یا کالاآزار گفته می­شود. راس  نیز در سال 1903 جنس لیشمانیا را معرفی کرد. لاوران ومسنیل در همان سال نام لیشمانیا دونووانی را به عنوان عامل بیماری کالا آزارپیشنهاد کردند. سپس تشابه شکل انگل زخم شرقی وعامل کالاآزار تایید گردید و لوهه در سال 1906 نام لیشمانیا تروپیکا را برای عامل زخم شرقی و یا سالک پیشنهاد کرد(53،95).  ونیون در سال 1911 خاطر نشان ساخت که فلبوتوم ممکن است ناقل بیماری های ناشی از لیشمانیا باشد. ولی 30 سال گذشت تا نظریه ونیون توسط آدلر  به اثبات رسید. این محققین نشان دادند که فلبوتوموس پاپاتاسی در حقیقت ناقل لیشمانیا تروپیکا به انسان است وسوامینات  و همکاران ملاحظه کردند که فلبوتوموس آرجنتیپس  ناقل لیشمانیا دونووانی است(86،87،93).

 

3-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در ایران

 

در کتاب قانون ابوعلی سینا در مورد زخمی به نام جیرونیه یا خیرونیه که درمان مشکلی دارد و در برابر داروهای گوناگون مقاومت می کند بحث شده است. در شرح اسباب ملانفیس از بیماری ای به نام شلیم نام برده شده که تظاهرات آن با زخم سالک مشابه است (3).

 

در اوایل قرن بیستم مطالعات کاملی درباره لیشمانیوز پوستی در تهران توسط دکتر پولاک که یکی از اساتید پزشکی مدرسه دارالفنون بود، انجام گرفت. وی شرح جامعی درباره بیماری سالک نوشت.

 

در سال 1916 گاشه از دیگر اساتید پزشکی دارالفنون 21 سگ را در تهران مورد مطالعه قرار داد که 15 سگ به سالک مبتلا بودند.

 

از  سال 1320 به بعد محققان ایرانی نظیر دکتر انصاری، دکتر مفید و دکتر ندیم در مورد اپیدمیولوژی، خصوصیات آزمایشگاهی انگل، گونه های پشه خاکی مناطق آلوده و درمان انواع سالک در نقاط مختلف ایران مطالعات و آزمایشاتی را انجام دادند(9). در 1328 برای نخستین بار دکتر پویا در مقاله ای سه مورد بیماری را که از لحاظ بالینی و آزمایشگاهی تشخیص آنها قطعی بود معرفی کرد و وجود کالاآزار در ایران را اعلام نمود.

 

از سال 1328 تا 1340تعداد 24 مورد کالاآزار از نقاط مختلف کشور نظیر تهران، تنکابن، آبادان، شیراز و نیشابور گزارش شد. از 1340 به بعد موارد بیشتری از بیماری بخصوص در استان فارس و بین عشایر بصورت تک گیر مشاهده شد. در فاصله سالهای 1353 تا 1358 فقط در بیمارستانهای وابسته به دانشگاه شیراز 131 مورد کالاآزار گزارش شد که اکثر بیماران اطفال زیر 7 سال بودند(2.3).

 

مطالعاتی که در سالهای 1364 تا 1368 در مشکین شهر استان اردبیل انجام گرفت نشان داد که بیماری در این مناطق از سالها قبل به صورت اندمیک (بومی) وجود داشته است و ممکن است در سالهای اخیر به صورت اپیدمی بروز کرده است. زیرا در این مدت بیش از 600 مورد کالاآزار از استان اردبیل تشخیص داده شد که 520 مورد آن در شهرستان مشکین شهر بوده است(2،6).

 

[1]-  Cuningham

 

[2] -leishman

 

[3] -Dum Dum fever

 

[4] -Charls Donovan

 

[1]- Novy- McNeal- Nicolle

 

[1] -Cutaneous Leishmaniasis

 

[2]-mocusal leishmanianiasis

 

[3] -visceral leishmaniasis

1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک

 

مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت.

 

 آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور و رابرت کخ باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند.

 

اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام كارهای معمول آزمایشگاهی كه می‌بایست كشت‌های باكتریایی را كه در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد كرده بودند زیر میكروسكوپ بررسی كند، متوجه شد كه در یكی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد كه ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود كه وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تكه‌ای كپك به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت كه كپك چیزی تولید می‌كند كه باعث مرگ باكتری‌های استافیلوكوكوس در ظرف كشت شده بود. فلمینگ كپك را جدا كرد و آن را به عنوان یكی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم شناخت، و ماده آنتی بیوتیكی را كه تولید می‌كرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد كه پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلكه عاملی شد تا برای كشف آنتی بیوتیك‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از تركیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد.

 

 در سال 1945 جایزه نوبل در پزشكی به طور مشترك به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004).  استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها  که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003).

 

1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها

 

بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز

 می‌دهند.

 

1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باكتری‌ها یك لایه خارجی سخت دارند كه دیواره سلولی آنها است و شكل میكروارگانیسم را تعیین می‌كند و از سلول باكتری كه فشار اسموتیك بالایی دارد محافظت می‌نماید . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها.

 

2-1-1-1- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین).

 

3-1-1-1- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA  می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند.

 

4-1-1-1- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یك غشای سیتوپلاسمی محصور شده كه به‌عنوان یك غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌كند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مكانیسم اثر پلی‌میكسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باكتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی كه با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، كلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول، ایمیدازول، تری آزول‌ها و یونوفورها اشاره كرد.

 

2-1-1- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک

 

ژن تولیدکننده آنتی‌بیوتیک و دیگر متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌ها معمولا به‌صورت کلاستر و یا به صورت پلاسمیدهای خطی بزرگ دیده می‌شوند. از نظر ژنتیکی آنتی بیوتیک‌ها با وزن مولکولی پائین، ساختار بسیار پیچیده دارند که نزدیک به 50 ژن در سنتز آنها دخالت دارد (Cundliffe, 2006). این در حالی است که یک ژن به آسانی می‌تواند یک پروتئین به وزن 100 کیلو دالتون را رمز گذاری کند(Challis, 2003). بعضی از جنس‌های استرپتومیسس بیش از 20 کلاستر ژنی را به سنتز متابولیت‌های ثانویه اختصاص داده‌اند. هر آنتی بیوتیک حدود 1% از کل ژنوم اکتینومیست تولید کننده را لازم دارد. علاوه بر ژن‌های لازم برای سنتز آنتی بیوتیک بعضی کلاستر‌ها دارای ژن‌های تنظیم کننده تولید آنتی بیوتیک می‌باشند (Cundliffe, 1989).

 

[1] . Clustered

 

[1] . Cidal

 

[2] . Static

 

[1] . Santonin

 

[2] . Cinchona  

 

[3] . Paul Ehrlich

 

[4] . Arsphenamine

 

[5] . Antibiosis

 

[6] . Vilmain

 

[7] . Antagonism

 

[8] . Louis Pasteur

 

[9] . Robert Koch

 

[10] . Allexander Fllemiing

 

[11] . Staphylococcus

 

[12] . Penicillium

 

[13] . Florey

 

[14] . Chain

 

[15] . Penicllium notatum

 

[16] . Gramicidin

 

[17] . Bacillus bervis

 

[18] . Streptomycin

 

[19] . Streptomyces

 

[20] . Waksman