1-1- ساختار و نمو لنز چشم.. 1

 

1-1-2- لنز جنینی.. 1

 

1-1-3- کپسول و اپیتلیوم لنز. 2

 

1-1-4- سلول های فیبری لنز چشم.. 3

 

1-1-5- مصرف انرژی و همئوستاز یونی لنز چشم.. 4

 

1-1-6- شفافیت لنز چشم.. 5

 

1-2- پروتئین های لنز چشم.. 6

 

1-2-1- آلفا-کریستالین.. 7

 

1-2-2- بتا-گاما کریستالین.. 10

 

1-2-3- بتا کریستالین.. 10

 

1-2-4- گاما کریستالین.. 10

 

1-3- برهمکنش کریستالین ها و تداخل بین آن ها 11

 

1-4- آب مروارید………..12

 

1-4-1- انواع آب مروارید وابسته به سن.. 13

 

1-4-1-1- آب مروارید هسته ای.. 13

 

1-4-1-2- آب مروارید پوسته ای.. 13

 

1-5- فرآیند توده ای شدن پروتئین های لنز و نقش آن در تشکیل آب مروارید. 14

 

1-6- فیبر آمیلوئید و ارتباط آن در تشکیل آب مروارید. 16

 

1-7- انواع تغییرات شیمایی پروتئین های کریستالین و نقش آن ها در بیماری آب مروارید. 17

 

1-7-1- قندی شدن غیر آنزیمی پروتئین آلفا-کریستالین.. 17

 

1-7-2- اکسایش پروتئین آلفا-کریستالین.. 18

 

1-7-3- دآمیناسیون، کوتاه شدگی و قطعه قطعه شدن پروتئین آلفا-کریستالین.. 19

 

1-7-4- هموسیستئینه شدن پروتئین آلفا-کریستالین.. 20

 

1-8- آنتی اکسیدان ها و پاک کننده های رادیکال آزاد لنز. 20

 

1-9- جریان یونی لنز و نقش آن در همئوستاز یونی.. 22

 

1-9-1- سدیم و پتاسیم.. 23

 

1-9-2- کلر. 24

 

1-9-3- روی.. 24

 

1-9-4- آهن.. 24

 

1-9-5- منیزیم.. 25

 

1-9-6- کلسیم.. 25

 

1-9-7- مس…. 27

 

1-9-8- سلنیم، سرب و کادمیم.. 28

 

1-10- 1- بیوشیمی پراکسی نیتریت به عنوان مولکول اکسایشگر طبیعی.. 29

 

1-10-2- پراکسی نیتریته شدن پروتئین ها  و آثار آن بر بدن.. 34

 

1-10-3- پراکسی نیتریت و بیماری های چشمی.. 40

 

1-11- پراکسی نیتریت و کلسیم.. 42

 

1-12-مس، اسید آسکوربیک و آب مروارید. 44

 

: مروری بر پژوهش های پیشین

 

مروری بر پژوهش های پیشین………………………………………………………………..45

 

اهداف پژوهشی…………………………………………………………………………………51

 

: مواد و روش ها

 

3-1-مواد مصرفی……………………………………………………………………………53

 

3-1-1- دستگاه ها……….…………………………………………………………………53

 

3-2- تهیه ی محلول ها …………….…………………………………………………….53

 

3-2-1-محلول برادفورد …….…………………………………….……………………….53

 

3-2-2-تهیه ی محلول های مورد نیاز روش الکتروفورز ژلی عمودی………………….55

 

3-2-2-1-تهیه ی محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید…………………………….55

 

3-2-2-2-تهیه ی محلول20 درصد SDS  ……………………………………….…….55

 

3-2-2-3-تهیه ی محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات………………………………..55

 

3-2-2-5-تهیه ی بافر تریس 5/0 مولار………………………………………………….56

 

3-2-2-4-تهیه ی محلول بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………56

 

3-2-2-6-تهیه ی بافر تانک……………………………………………………………….56

 

3-2-2-7-تهیه ی بافر نمونه X2………………………………………………………….57

 

3-2-2-8-تهیه ی محلول رنگ‌آمیزی کوماسی بلو………………………………………57

 

3-2-2-9-تهیه ی محلول رنگ بر کوماسی بلو…….…………………………………….58

 

3-2-3-تهیه ی محلول های مورد نیاز سنجش گروه کربونیل………………………….58

 

3-2-3-1-تهیه ی محلول 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………….58

 

3-2-3-2-تهیه ی محلول اسید تری کلرو استیک (TCA) 20 درصد…………………59

 

3-2-3-3-تهیه ی محلول اتانول-اسید اتیل استیک (نسبت 1:1 ، حجمی)………….59

 

3-2-3-4-تهیه ی محلول گوانیدین هیدروکلراید 6 مولار………………………………59

 

3-2-4-تهیه ی محلول استوک ANS ………………………………………………………………………….60

 

3-2-5-تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین-…………………………………………….T60

 

3-2-6-تهیه ی محلول استوک اسید آسکوربیک………………………………………..61

 

3-2-7-تهیه ی محلول های پروتئینی و تعیین غلظت آن ها……..…………………….62

 

3-2-7-1-تهیه ی محلول انسولین…….………………………………………………….63

 

3-3- تهیه ی محیط های کشت باکتری………………………………………………. 64

 

3-3-1- تهیه ی محیط کشت جامد………………………………………………………64

 

3-3-2- تهیه ی محیط کشت مایع……………………………………………………….65

 

3-4- روش ها……………………………………………………………………………….65

 

3-4-1- آماده سازی پروتئین های لنز چشم گاو………………………………………..65

 

3-4-2- بیان زیر واحد هایαA  و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21 ……. 66

 

3-4-3- تخلیص زیر واحدهایαA  و αB-کریستالین انسانی……………………………67

 

3-4-4- تعیین میزان خلوص پروتئین به روش SDS-PAGE …………….…..……… 69

 

3-4-5-فرآیند سنتز پراکسی نیتریت………………………………………………………69

 

3-4-6- فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز چشم وαA  و αB-کریستالین انسانی….………………………………………………………………………..72

 

3-4-7-مطالعه ی هضم آنزیمی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییریافته با آنزیم آلفا-کیموتریپسین….…………………………………………………………………72

 

3-4-8-سنجش مقدار گروه های کربونیل پروتئین های محلول لنز چشم وαA  و αB-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته……………………………………………………73

 

3-4-9- مطالعه فرآیند توده ای شدن پروتئین های کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………74

 

3-4-10- مطالعه ی فلورسانس پروتئین های محلول لنز چشم و αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………………………74

 

3-4-10-1- مطالعه ی فلورسانس ذاتی………………………………………………….75

 

3-4-10-2- مطالعه ی فلورسانس عارضی ANS))……………………………………..76

 

3-4-10-3- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-………………………………………..T77

 

3-4-11- الکتروفورز ژلی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم…………………………………………………77

 

3-4-12- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته  بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس……………………………………………79

 

3-4-13- مطالعه ی فعالیت چاپرونی αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………….………….………………………………………………………80

 

:  نتایج و بحث

 

بخش اول……………………………………………………………………………………………………………………82

 

4-1- مطالعه ی اثر پراکسی نیتریته شدن بر ساختار، ایجاد حالت الیگومری و توده ای شدن پروتئین های لنز چشم در حضور یون کلسیم…………………………………………………82

 

4-1-1-نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در بیماری زایی عارضه ی آب مروارید……..83

 

4-1-2-مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز……………..85

 

4-1-2-1-سنجش تغییر حرکت ژل الکتروفورز پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………..85

 

4-1-2-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های لنز تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………………………..87

 

4-1-2-3- مطالعه ی فلورسانس ANS پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

 

4-1-2-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

 

4-1-2-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین های کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………….90

 

4-1-3-مطالعه ی ناپایداری پروتئولیزی پروتئین های لنز  تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..90

 

4-1-4-مطالعه ی توده ای شدن پروتئین های طبیعی و تغییر یافته ی لنز به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم………………………………………………………………….92

 

4-1-5-ارزیابی الیگومری شدن پروتئین های لنز طبیعی و تغییریافته در حضور یون کلسیم به وسیله ی الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………94

 

4-1-6-مطالعه ی فلورسانس عارضی پروتئین های طبیعی و تغییر یافته لنز در حضور یون کلسیم………………………………………………………………………………………………………………….99

 

4-1-7-مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی کریستالین های طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………101

 

بخش دوم…………………………………………………………………………………………………………………104

 

4-2- مطالعه ی ساختار و فعالیت چاپرونیαA -کریستالین های انسانی طبیعی و پراکسی نیتریته شده و بررسی نقش محافظتی آن ها در برابر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون های مس………………………………………………………………………………………104

 

4-2-1- بیان زیر واحد هایαA  و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21………………………………………………………………………………………………………………………105

 

4-2-2-تخلیص پروتئین هایαA  و αB-کریستالین انسانی…………………………………106

 

4-2-3- مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئینαA -کریستالین انسانی……………………………………………………………………………………………………………………….108

 

4-2-3-1- مطالعه ی الکتروفورز ژلی پروتئینαA -کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………..108

 

4-2-3-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های αA و αB-کریستالین تغییریافته به وسیله ی پراکسی

 نیتریت………………………………………………………………………………………..109

 

4-2-3-3- مطالعه ی فلورسانس تریپتوفان و عارضی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….110

 

4-2-3-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..111

 

4-2-3-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….111

 

4-2-3-6- مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته……………………………………….…………………………………………….112

 

4-2-4- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته  بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس………………………………………………………..114

 

4-2-5-مطالعه ی فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته………………………………………………………………………………………………………………………….116

 

4-2-6- مطالعه ی فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس………………………………………………………………………………………………………..117

 

………………………………………………………………………………………………….119

 

……………………………………………………………………………………..121

 

ساختار و نمو لنز چشم

 

لنز[1] یک عضو کلیدی انکساری چشم است. لنز دارای شکل دوسوکوژ با خاصیت انکساری بالا و شفافیت کامل است که به کمک قرنیه تصاویر را بر روی شبکیه[2] متمرکز می کند. ساختار شفاف لنز که در پشت عنبیه قرار دارد به وسیله ی زنول ها[3] در زلالیه[4] معلق شده است. زنول ها به جسم مژگانی[5] که پیرامون لنز را احاطه کرده است متصل شده اند. ماهیچه های درون جسم مژگانی با تغییر کشش رباط ها، شکل لنز را تغییر می دهند. چشم با تغییر شکل لنز، می تواند بر روی اشیاء در فواصل گوناگون تمرکز کند که به این عمل تطابق[6] گفته می شود (Michael و Bron 2011، Loh و همکاران 2009). در بزرگسالان، لنز با ضخامت  5/3 تا 4 میلیمتر و با قطر 9 تا ۱۰ میلیمتر دیده می شود Forrester) و همکاران 1996).

 

 1-1-2- لنز جنینی

 

لنز چشم یک بافت بدون رگ پوشیده شده با کپسول کلاژنی محکم اما پر منفذ است که از یک لایه از سلول های اپیتلیال در سطح پیشین تشکیل شده است (Donaldson و همکاران 2010، Kuszak 1984). لنز تمام مواد غذایی و اکسیژن را از زلالیه به دست می آورد. در ناحیه ی استوایی لنز، سلول های اپیتلیال تمایز و طویل شدن را آغاز می کنند تا به سلول های فیبری تبدیل شوند. در طول این زمان سلول های اپیتلیال اندامک خود را از دست می دهند و سنتز مقدار زیادی از پروتئین های ساختاری کریستالین را آغاز می کنند (شکل 1-1). این فرآیند در طول زندگی با سرعت آهسته تری  همراه  با راندن سلول های فیبری جدیدتر یا جوان تر به ناحیه ی مرکزی (هسته) ادامه پیدا می کند (Jaffe و Horwitz 1991، Lovicu و Robinson 2004). تکامل لنز با فرورفتگی پلاک لنز[7] به طرف فنجان بینایی[8] و تبدیل شدن به حفره ی لنز آغاز می شود. ضمن ادامه ی این فرورفتگی، حفره بسته می شود و وزیکول لنز[9] در انسان طی روز سی و سوم جنینی تشکیل می شود. پس از آن، تمایز سلول های اپیتلیال، پر شدن وزیکول را آغاز می کند تا همه ی حفره در انتهای هفته ی هفتم با سلول های فیبری گرفته شود. سلول های فیبری اولیه که مرکز لنز را اشغال کرده اند هسته جنینی را تشکیل می دهند (Lovicu و Robinson 2004، Kuszak 1984). تکامل لنز بدون از دست دادن همه ی اندامک های متفرق کننده ی نور از سلول های فیبری کامل نمی شود. این عمل در یک فرآیند برنامه ریزی شده به وسیله ی پروتئاز ها انجام می شود (Bassnett 2009، Bassnett 2002). لنز بیضی شکل جنینی در آغاز دارای قطر 35/0 میلی متر است که به سرعت رشد خود را آغاز می کند تا به یک اندام بیضی شکل حدود 35 میلی گرم در هنگام تولد تبدیل شود. مطالعات بر روی لنز های انسان در سنین بین شش ماه تا نود و نه سال نشان می دهد که لنز در دو فاز شامل فاز مجانبی (Asymptotic) در طول دوره ی پیش از تولد و ابتدای کودکی و فاز خطی در باقی مانده ی زندگی شخص رشد می کند (Jaffe و Horwitz 1991، Augusteyn 2007). چون لنز از فیبرهایی که نشان دهنده ی سنین مختلف است تشکیل شده، بافت جذابی  برای مطالعه ی اثرات پیری بر عملکرد و ساختار پروتئین است ( Sharmaو Santhoshkumar 2009)

 

1-1-3- کپسول و اپیتلیوم لنز

 

کپسول لنز[10] یک غشای پایه الاستیک با ساختار لایه ای است که در قسمت جلو از سلول های اپیتلیال و در قسمت عقب از سلول های فیبری تشکیل شده است. ترکیبات کلاژن نوع IV[11]، لامینین[12]، انتاکتین[13]، هپارین سولفات پروتئوگلیکان[14] و فیبرونکتین[15] از از اجزای اصلی کپسول لنز هستند و به قالب بندی شکل لنز کمک می کنند (Jaffe و Horwitz 1991). کپسول لنز در هنگام تولد 4 میلی متر ضخامت دارد و در طول زندگی رشد می کند اما با افزایش سن ضخامت آن به 30 میلی متر در ناحیه ی سطحی کپسول پیشین می رسد. ویژگی های مکانیکی کپسول لنز با افزایش سن کاهش می یابد که می تواند به تغییرات رخ داده در کلاژن کپسول نسبت داده شود (Danysh و Duncan 2009). یک لایه از سلول های اپیتلیالی مکعبی قسمت جلویی لنز را می پوشاند که می تواند به دو ناحیه شامل اپیتلیوم مرکزی تقسیم نشده و اپیتلیوم تقسیم شده (زایشی) که در ناحیه ی قوسی تمایز می یابد تقسیم می شود. در طول عمر فرد سلول های اپیتلیال لنز ویژگی های مشخصی از تقسیم و تمایز به سلول های فیبری جدید دارند اما این فرآیند با افزایش سن کاهش می یابد. اپیتلیوم لنز[16] قسمت بزرگی از انتقال، سوخت و ساز و سم زدایی است، چون سلول های فیبری لنز حجمی از مواد مغذی را از طریق سلول های اپیتلیال می گیرند (  Sharmaو Santhoshkumar 2009، Balaram 2000). سلول های اپیتلیال اولین خط دفاعی علیه ترکیبات اکسایشی فراهم می آورند (Andley 2008).