با وجود دستیابی به کارآیی نسبتاً بالا در تکنیک های انجماد اسپرم و جنین در پستانداران و از جمله گونه گوسفند، هنوز تکنیک مؤثری به منظور انجماد تخمک های این گونه حیوانی شناسایی نگردیده است. از جمله مهم ترین اهداف انجماد تخمک در نمونه های حیوانی می توان به حفظ و مدیریت ذخایر ژنتیکی، توسعه علم مهندسی ژنتیک، ارتقای تکنیک انتقال هسته[1] (NT) در روند شبیه سازی، تهیه منابع کافی جهت انجام تحقیقات بنیادین، صادرات کم هزینه صفات ژنتیکی برتر و ایجاد بانک تخمك اشاره نمود. علاوه بر این با حفظ و ذخیره سازی طولانی مدت این منابع (تخمك) امکان اعمال برنامه های مدیریتی قویتر در مورد گونه های جانوری در معرض خطر انقراض و در انسان نیز امکان حفظ باروری در زنان در معرض خطر اختلال در عملکرد تخمدان به علت درمانهای خاص (شیمی و پرتو درمانی)، جراحی، نارسایی زودرس تخمدان و … فراهم می گردد؛ ضمن این که انجماد تخمک در نمونه های انسانی هیچ یک از مشکلات و محدودیت های اخلاقی و حقوقی انجماد جنین را نیز به همراه ندارد.  مطالعات نشان می دهند که در تخمک های منجمد- ذوب شده، آسیب های فراساختاری، مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی متعددی به چشم می خورد که مهم ترین آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غیرقابل برگشت به غشاء پلاسمایی تخمك، کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی، اگزوسیتوز زودرس گرانول های کورتیکال، سفت و سخت شدن زوناپلوسیدا، کاهش شدید میکروویلی ها، بهم ریختگی شدید اووپلاسم، تغییرات شدید و کاهش مشخص دستجات میکروتوبول ها و میکروفیلامان ها، بهم ریختگی دوک تقسیم و حرکت اجزاء اطراف سانتریول ها به مرکز تخمك، خرد شدن هسته، افزایش احتمال پارتنوژنزیس، کاهش شدید فاکتور پیش­برنده میتوز MPF[2]، کاهش مشخص متابولیت ها و پروتئین ها، آنپلوییدی و پلی پلوییدی اشاره نمود .

در این مطالعه به بررسی افزودن برخی عوامل مؤثر در روند اتجماد تخمک مانند آلدوسترون در محیط های اختصاصی کشت جنین و تأثیر آنها بر بیان پروتیین مورد نظر (Na/K ATpase)در مراحل مختلف جنینی
می پردازیم. بدیهی است نتایج حاصل از این مطالعه ضمن مشخص نمودن میزان تاثیر عامل افزوده شده بر روند تکامل تخمك و جنین های حاصله از انجماد، امكان ارتقای كیفی روش های انجمادی تخمك مبتنی بر نتایج بدست آمده را نه تنها در این گونه جانوری بلكه در سایر پستانداران از جمله انسان فراهم نموده و بدین ترتیب گامی موثر در جهت رفع معضل تکامل تخمک های انجمادی از مورولا به بلاستوسیست در پستانداران برداشته خواهد شد. لازم به ذکر است تا به حال تأثیر آلدوسترون در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده گوسفند بررسی نگردیده است و در صورت وجود تأثیر مثبت در این زمینه، موجب تحول روش های انجماد تخمک در گوسفند و حتی سایر گونه ها خواهد شد.

2-1- اهداف پژوهش

1- بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در طی IVM و مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا .

2- ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای کیفی(جنین­های حاصله از افزایش میزان تفریخ، ICM/Total) عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.

3-1- ضرورت انجام تحقیق

این پروژه با هدف پاسخ به برخی از سؤال های زیر طراحی گردید: بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های

 منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا؛ بررسی ارتباط بین تجویز هورمون های فعال کننده تحت واحد های 1α و 1β پمپ Na+/K+/ATPase و میزان افزایش عملکرد آنزیم مذکور در مرحله انتقال از مورولا به بلاستوسیست و متعاقباً بهبود روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده و ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.

4-1- تولید جنین در شرایط In vivo

1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده

واحدهای عملكردی تخمدان فولیكول نام دارند كه تحت سازماندهی سلولی خاص تخمک را در خود جای داده‌اند. این سازماندهی سلولی ثابت نبوده و در طی مراحل مختلف زندگی فولیكول تغییرات پیچیده‌ای می‌یابد. حاصل این تغییرات به آزاد شدن تخمک و یا تحصیل فولیكول رسیده منجر خواهد شد ]132،54[.

تولید مثل با تكامل تخمك‌ها در تخمدان آغاز می‌گردد. تعداد 1 تا 25 تخمك، بسته به گونه حیوان، در مرحله‌ای از سیكل جنسی حیوان ماده به نام فاز اوولاسیون  از فولیكول تخمدانی به داخل حفره شكمی آزاد می‌شوند. سپس این تخمك‌ها از طریق لوله رحمی مربوطه وارد رحم می‌شوند. فولیكول‌های تخمدانی متعددی در مراحل مختلف تكاملی در استرومای كورتكس واقع شده‌اند. بیشترین فولیكول‌ها، فولیكول‌های پریموردیال هستند. هر فولیكول پریموردیال حاوی یك تخمک اولیه است كه توسط یك لایه از سلول‌های فولیكولی سنگفرشی احاطه شده است. در ادامه رشد این فولیكول‌ها، سلول‌های فولیكولی تبدیل به سلول‌های مكعبی یا استوانه‌ای كوتاه می‌شوند ]148،81 [.

مجموع وقایعی كه منجر به تولید سلول زایایی تخمک در جنس ماده می‌شود، باعث بروز تمامی واكنش‌های لازم قبل، حین و بعد از واكنش با اسپرم در تخمک می ‌شود که شامل یك پروسة طولانی از تمایز اووگونی در تخمدان جنینی تا بلوغ نهایی تخمک، درست قبل از اوولاسیون آن می‌باشد.

از مدت‌ها قبل مشخص شده كه فقط تعداد كمی از تخمک‌های اولیه حیوانات و نیز انسان می‌توانند رشد ثانویه خود را دنبال کرده، تبدیل به تخمک ثانویه شده و تخمك‌گذاری كنند. بطور مثال در مورد گاو تخمین زده اند که در تخمدان‌های گوساله تازه متولد شده حدود 200.000 تخمک وجود دارد که احتمالاً كمتر از 300 عدد آن‌ها به مرحله تخمك‌گذاری می‌رسند] 52،136،20[.

در فرآیند بلوغ، اووسیت اولیه، پروفاز نخستین تقسیم میوزی پس از تولد را تکمیل می‌کند. در زمان بلوغ، تغییرات بعدی رخ می‌دهند. اووسیت اولیه حاوی تعدادی کرموزوم‌های دیپلوئید (xx) است. به طوری که در مرحله‌ی بلوغ، اووسیت بزرگ شده، سلول‌های فولیکولی، مکعبی و به چندین لایه تکثیر می‌یابند. همچنین یک غشای مخطط به نام زوناپلوسیدا، پیرامون اووسیت تشکیل می‌شود (این لایه با به هم پیوستن زواید اووسیت اولیه و گلیکوپروتئین موجود در محل تشکیل شده است)، فولیکول بزرگ شده و فضاهای پر از مایع، بین سلول‌های فولیکولی، پدیدار شده و به هم می‌پیوندند تا آنتروم فولیکول را تشکیل دهند. به همین دلیل، سلول‌های فولیکولی، تفکیک می‌شوند تا لایه‌ی گرانولوزوم و کومولوس اووفوروس، را تشکیل دهند. تک خارجی (لایه‌ی فیبروزی) و تک داخلی (لایه‌ی عروقی و سلولی) به وسیله‌ی سلول‌های استرومایی تخمدان در خارج از لایه‌ی گرانولوزوم، به وجود آمده و به این ترتیب، فولیکول گراف بالغ به وجود می‌آید. اووسیت اولیه، نخستین تقسیم میوزی را که در خلال حیات پیش از تولد آغاز شده بود، کامل می‌کند. در نتیجه دو سلول دختر هر یک با تعداد کروموزوم‌های هاپلوئید (n) تشکیل می‌شوند. در این فرآیند تقسیم هسته‌ای برابر بوده اما تقسیم سیتوپلاسمی نابرابر است. بنابراین یک سلول دختر که سیتوپلاسم فراوانی از سلول مادر دریافت کرده، بزرگ می‌شود. این سلول اووسیت ثانویه نامیده می‌شود. سلول کوچک، نخستین گویچه‌ی قطبی است که در فضای پیرامون زرده‌ای جای داده می‌شود. در شکل 1-1 روند کلی انجام اووژنز آمده است.

تخمک گذاری، هنگامی رخ می‌دهد که یک فولیکول گراف بالغ در سطح تخمدان، پاره شود. تخمک‌گذاری می‌تواند در هر نقطه از سطح، به جز ناف تخمدان صورت گیرد. در این فرآیند، اووسیت ثانویه‌ی احاطه شده به وسیله‌ی زوناپلوسیدا و سلول‌های کومولوس اوفوروس از تخمدان بیرون رانده می‌شوند.

[1]- Ovulatian

[2]- Ovulation phase

[3]- Primordial follicle

2- Zona pellucida

[5]- Antrum folliculi

[6]- Stratum granulosum

4- Cumulus oophorus

5- Theca externa

6- Theca interna

[10]- First polar body

[11]- Perivitelline space

[12]- Ovulation

[1] – Nuclear transfer

[2] – Mitotic promoting factor

[1] – Asisted  Reproductive Technology